附录A。规范性附录,陆生植物生长试验A.1。受试物信息、受试物信息包括但不限于 水溶性.蒸汽压，结构式，有机溶剂中的溶解度，正辛醇.水的分配系数 吸收行为.纯度.在水和光中的稳定性.生物降解试验的结果,A 2、试验简介A 2.1.试验目的,用于评价在一次性施用后。土壤中固态和液态的化学物质对植物幼苗和早期生长的潜在毒性效应、A,2、2。试验原理 本附录用于评价在土壤中，或其他合适的土壤基质、施用供试品后对出苗和较高植物早期生长的影响.种子种入供试品处理过土壤中 在对照组出苗率达到50,后的14d、21d内进行评价、终点测量是可见的出苗率 苗干重.也可为鲜重。某些情况下为苗高,也要评价植物不同部位上可见的有害的影响 这些测量和观察与未处理的对照进行比较 根据可能的暴露途径 供试品混入土壤,或可能的人工土壤基质，或喷洒在土壤表面，这些途径要尽可能正确代表化学品潜在的暴露途径 土壤混合时先进行大量散土的混合 然后再装入盆中.将所选植物种子种入土壤中,表面施药时.先将土壤装入盆中,将种子种好 然后再喷药，试验体系 对照和处理土壤及种子，放在适合植物生长的环境中。本附录可根据研究目的测定剂量、反应曲线、或单剂量,比率作为限度试验 如果单剂量.比率试验超出一定的毒性水平.例如观察到的效应高于x,要进行范围筛选试验测定毒性高限和低限、再进行多剂量试验产生剂量 反应曲线.适当的统计分析方法分析获得最敏感参数的作用浓度ECx、或有效施用率ERx、如、EC25.ER25.EC50.ER50.同样无作用浓度,NOEC、和最低作用浓度.LOEC,也能计算出来 A，2,3 参比物.定期进行参考物质试验 以确认随着时间的推移试验性能和特定植物的反应和试验条件没有明显改变 可选的方法还有.实验室用以往的对照组生物量测定或生长测量来评价试验系统的性能.可以作为实验室内部质量控制，A,2，4.限度,本附录不能给出由受试物蒸发所造成的可能伤害结果、也未测定由于直接接触植物所产生的伤害,A,3。设备与材料，人工生长箱 温室或植物生长箱。生长容器应为塑料器皿或瓷盆钵.A、4,试验操作A,4 1，准备自然土 人工基质.可用含1。5，以上有机碳。有机质约3 的沙壤土。壤质沙土或沙质黏壤土装入花盆 种入植物，含1,5 以上有机碳的商业盆栽土或合成混合土均可用,如果供试品黏土有很高的亲和力、则不可用黏土。耕地土应过2mm筛使之均一,并去除粗糙颗粒。最终准备土壤的类型和构造,有机碳.pH，盐含量和电导率应报告。土壤应巴氏消毒或热处理消毒以减少土壤病菌的影响.由于物理、化学特征和微生物群落的改变.自然土可能使结果的解释复杂化，增加变异性、这些变异依次为土壤持水能力。化学结合能力.通风、营养和微量元素含量，除了物理因素的变异外.在化学特性上的变异,如pH和氧化还原电位 可以影响供试品的生物可用性、为尽可能减少自然土的变异性对试验带来的误差，当受试物不是植物保护产品时 可用人工基质代替自然土进行试验,所用基质应包含惰性物质，减少与供试品,溶剂载体或两者的相互反应 用酸洗过的石英砂.矿物丝和玻璃珠。如。直径0。35mm,0。85mm。是合适的惰性物质、可减少对供试品的吸收、保证供试品最大可能地经根吸收达到幼苗。不适合的基质包括蛭石，珍珠岩或其他高吸收性的材料、应提供植物生长所需的营养，以保证植物没有营养缺乏的压力.可通过化学分析或对照植物的可见评价进行评价.A 4,2 供试植物、选择植物的种类应考虑其在植物界中分类学上的多样性、分布特征 种的特定生活史和自然界分布地区差异。具体包括下列特征.有均一的种子，从可靠的标准种子来源获得 能产生持续 可靠和一致的萌芽,以及一致的幼苗生长，植物应适于在实验室进行试验。在实验室内及实验室之间能够得出可靠和可再现的结果，所用种的敏感性应与环境暴露中的植物反应一致,所选种已用以往的一些毒性试验、它们在如除草剂生物测定,重金属筛选、盐度或矿物压力试验或植物相克研究中的使用表明对宽泛多样性刺激存在敏感度 能够适应试验方法中的生长条件,符合试验有效性标准。试验所用的种类数量根据相关的管理要求决定.附录C中的植物测试试验用物种供参考，A。4，3.供试品的施入 供试品应添加到适当的载体上.如,水 丙酮.乙醇。聚乙二醇,阿拉伯树胶，砂、也可用包含有效成分和各种助剂的制剂进行试验,A、4，4 与土壤。人工基质的混合.溶于水或可悬浮在水中的物质可以直接配成水溶液、然后将水溶液与土在适当的容器中混合，此种类型试验适合化学品通过土壤或土壤毛细水吸收。涉及根的吸收,供试品添加量不应超过土壤持水力 每个浓度添加的溶液量应一致，但要注意避免土壤结块，水溶性低的物质应先溶入适当的挥发性溶剂中,如.丙酮、乙醇、并与沙混合、用气流将溶剂从沙中去除.处理的沙子与试验土壤混合.设置只加沙子和溶剂的溶剂对照.各处理和溶剂对照应加等量的混入溶剂并已去除溶剂的沙子.对于固体和不溶于水的供试品，直接和干土混合。此后，将土加入容器中，并立即种入种子,用人工基质代替土壤时，在试验开始前可直接将溶于水的化学品溶解到营养液中,不溶于水，但可以通过溶剂载体悬浮于水中的、可加入载体。再溶于营养液中、不溶于水.但没有无毒的水溶性载体 可先溶于适当的挥发性溶剂,溶液与沙子或玻璃珠混合.在旋转蒸发仪上蒸发 使化学品均匀地覆着在沙粒或珠子上、在分装之前，取一部分称重的玻璃珠用等量溶剂提取，进行化学分析,A。4,5.表面施用。对于作物保护产品，通常用土壤表面喷洒试验溶液的方法进行施药，进行试验操作的所有设备，包括准备和喷洒供试品的设备,都应使试验以精确的方式进行 能够产生可重现性覆盖.覆盖应均一分布在土壤表面，应避免化学品被设备吸收或与设备反应的可能、如,塑料管与亲脂性化学品易反应，或某些化学品对钢材质设备有腐蚀性。模仿典型的喷雾器将供试品喷洒在土壤表面,通常.喷洒量应在正常农用量的范围内 用量.水的量等，应报告，选择喷嘴类型以保证均一的土壤表面覆盖量、如果应用溶剂和载体，应设置溶剂.载体对照.不必试验作物保护产品的制剂、A。4.6,供试品浓度 比率的验证,浓度应经适当的分析方法验证,对于可溶性物质。所有浓度的验证可以通过分析用于逐级稀释的最高浓度来确认.用校准设备，如，校准分析用玻璃器具、校准喷雾设备,进行逐级稀释 对于不溶于水的物质、分析添加到土中的量,如果要证明供试品在土壤中的均一性 有必要进行土壤分析，A,4、7 试验条件.试验条件应与试验种和变种的正常生长条件相似，出苗的植物应放在可控的气候培养箱 人工气候箱或温室中进行园艺操作维持正常生长.采用生长设备时，应保证植物正常生长、并与对照组对照 应记录包括条件控制和足够频率,如、每日，的温度、相对湿度 二氧化碳浓度.光、照度。波长 光合有效辐射,光周期,平均灌溉量等参数.温室温度通过通风。升温和.或制冷系统来控制，下列条件通常为温室试验的推荐条件,温度 22。10，相对湿度 70 25。光周期，最少16h光照，照度。24850、3550.lx。如果照度降到14200、lx以下.波长400nm，700nm.除某些种需减少照度外。需补充光照。试验期间应监测和记录环境条件,试验所用容器应为无孔塑料或玻璃容器 容器下面应垫上托盘或碟子,容器应定期重新摆放以减少植物的生长差异.因为生长设施的试验条件不同 容器应足够大以保证正常生长.为维持好的植物活力。可以添加土壤营养液，通过观察对照植物判断添加营养液的需要和时机。推荐从试验容器底部浇水 如，用玻璃纤维丝.对试验植物种和供试品来说，特定的生长条件是适合的，参见附录D,对照和试验组植物应放置在一样的试验环境条件下，然而,应采取必要的措施防止不同处理间及对照与供试品间的交叉污染。如 挥发物质 A 4 8。试验操作A 4，8,1 试验设计.同样种类的种子种植于容器中.每个容器中种入的种子数目应根据植物种类。容器大小和试验周期决定.试验期间给植物提供充分的生长条件.避免过于拥挤，根据种子大小,最大的植株密度为3粒.100cm2.10粒,100cm2。例如，每个直径为15cm的容器内 可种1株、2株玉米，大豆,西红柿.黄瓜或甜菜,可种3株油菜或豌豆、可种5株，10株洋葱。小麦或其他小粒种子,种子数量和重复容器。一个重复指一个容器.容器内的植物不是重复,应足以采用理想的统计分析方法进行统计.每个重复用很少的大种子比每个重复用小种子时变异会较大，应标记。可以通过每个容器内同样数量的种子降低变异。设置对照组保证观察到的效应与暴露的供试品有关或由供试品引起.除了不暴露于供试品外,适当的对照组应与试验组在各方面都一样。所有被试植物包括对照均应来自同一来源 为避免偏离.对照和试验组植物应随机分布、应避免使用杀虫剂或杀菌剂包被的种子 即 包衣。种子、特殊情况下允许使用某些非内吸性接触杀菌剂。如，克菌丹 福美双，如果有种生病菌，可以把种子在5、次氯酸盐中浸一下 然后在流水下漂洗再晒干,允许其他作物保护产品的非治疗性处理,A.4、8、2 单浓度、比率试验、进行单浓度试验、限度试验，时。未确定适当供试品浓度.需要考虑很多因素，对一般化学品来说,应考虑物质的物理,化学特性、对作物保护产品而言。需要考虑物理,化学特性 供试品的使用模式,最大浓度或施用比率.每个生长季节施用次数和。或试用品的持久性,为测定一般化学品是否有植物毒素特性，通常以1000mg,kg干土作为最大剂量。A。4，8 3，预试验.进行正式的多浓度的剂量反应研究前 需先进行预试验确定剂量范围、预试验的浓度间距应较宽。如，0。1mg、kg，1、0mg,kg，10mg。kg、100mg。kg和1000mg、kg干土，作物保护产品的浓度应根据推荐或最大使用浓度或施用比率确定、如推荐、最大浓度或施用比率的1。100.1.10和1，1，A、4，8、4,多浓度,比率试验、多浓度，比率试验的目的是建立剂量反应关系和测定萌芽率、生物量的ECx或ERx值和，或与未给药的对照组比较的可观察效应、试验浓度，比率的数量和间距应足够产生可信的剂量反应关系和回归线性方程并能得出估计的ECx或ERx值 所选浓度数量至少五个几何级数并加上对照。相邻的两个浓度梯度不应超过3个几何级、每个处理和对照均至少有四个平行。总的种子数应至少20粒.对某些萌芽率低的植物或多样化的生长特征的植物、增加平行数提高统计效力,A、4。8、5.观察，在观察期内，即对照、溶剂对照、出苗率达到50、后的14d，21d内，定期。至少1周。若可能每日、观察植物是否出苗和可见的植物中毒死亡。在试验结束时，记录出苗率,存活植物的生物量和植物不同部位可见的毒害效应、后者包括已出幼苗形态上的异常.生长迟缓,枯萎.变色、死亡和植物发育上的影响。最终生物量通过测定最终存活植株的平均苗干重完成，收割土壤表面以上的植株,在60，烘干至恒定的质量，也可选择以鲜重作为最终生物量，如有特殊要求，苗高可作为另一个重点指标.可用一个统一的评分系统对可见的伤害进行评分来评价可观察的毒性反应.A。5，质量控制.为保证试验的有效性 对照应符合下列形态标准,出苗率至少70.幼苗没有可见的植物毒素影响,如,变色病。坏死病，枯萎，叶子和茎的畸形 个别种类的植株在生长和形态上只有正常变异,试验期间，对照组幼苗平均存活率应高于90,特定种类的环境条件应一样.生长介质包含等量的人工土壤基质.支持介质或同样来源的物质.A 6、数据和报告A.6 1、数据处理A，6 1 1，单浓度.比率试验 每个植物种的数据都应用适当的统计方法进行分析,报告试验浓度，比率产生的效应水平。或试验浓度,比率下未见效应 如在y浓度或比率观察的效应,x A.6 1。2、多浓度 比率试验、根据回归方程剂量。反应关系、可用不同的模型。如、出苗率等计数型数据ECx或ERx。如 EC25 ER25 EC50或ER50 和置信限的估算可用逻辑回归法、概率法.韦博法、寇氏法进行统计,幼苗生长。质量和高度.等连续型终点指标ECx或ERx和可信限的估算可用适当的回归分析。如 Bruce,Versteeg非线性回归分析,如果可能，R2值为0,7或再高些。对多数敏感种来说,所设浓度,比率包含20 和80,效应。如果要求NOEC。要求有更强大的分析性试验 并且要在数据分布基础上选择.A，6,2 试验报告、试验报告应包括试验结果.试验条件的详细描述,结果的全面讨论,数据的分析和结果分析,提供结果图表和摘要、通常包括下列内容.a、供试品,化学鉴定数据,相关物质特性.如可能、正辛醇，水的分配系数1gPow、水溶解度、蒸汽压。环境归宿和行为的信息，试验溶液的制备细节和试验浓度的验证,b,试验植物种.试验生物的详细资料，种.亚种,所属植物科、学名和通用名。尽可能详细的来源和历史 即,提供者的名称、萌芽率.种子尺寸级别,批号。产种年或选择的生长季节，萌芽期等级，生存力等 所试验的单子叶和双子叶种的数量。选择此种的理由、种子贮存.处理和维护的描述,c、试验条件，试验设施.如、生长箱,人工气候箱和室温,试验系统的描述，如，容器直径，容器材料和土壤量。土壤特性，土壤质地或类型,土壤颗粒分布和分级，物理化学特征.包括有机物含量，有机碳含量和pH值，试验前土壤，基质。如.土壤，人工土壤 沙子和其他。的制备.若用营养液、配方描述,供试品的施用 施用方法 设备。暴露承载量和体积。包括化学验证.校准方法.施药期间环境条件的描述,生长条件、照度，光周期。最高、最低温度,浇水时间表和方法.施肥，每个容器内的种子数量 每个剂量植株数。每个暴露率的重复数、对照的类型和数量.阴性对照和 或阳性对照。溶剂对照.试验周期、d.结果,每个重复 试验浓度，比率和种子的所有终点数据表 与对照比较的萌芽数量和萌芽率,植株生物量,植株干重或鲜重,测定值与对照比率.若测量 植株高度与对照的比率、与对照比较的由供试品引发的可见的伤害率和可见的定性定量描述、黄化,坏死。枯萎。叶和茎的畸形和缺乏症,如果提供可见伤害评分标准 判断可见伤害描述、对于单剂量试验。应报告伤害率，ECx或ERx 如，EC50.ER50，EC25、ER25、值和相关置信限、如果有回归分析。提供回归方程标准偏差,单个参数估计标准偏差、如、斜率.截距，若计算。NOEC，和LOEC,值。统计过程和假设检验的描述。数据表和试验种的剂量.反应关系图 试验过程中与方法的偏离和试验中不可预见的情况的描述.